Конфокальна лазерна мікроскопія, що сканує. Конфокальна оптична сканувальна мікроскопія Конфокальна електронна мікроскопія

Основна концепція

Конфокальний принцип точка датчика з патенту Мінськ

Принцип конфокальної мікроскопії був запатентований у 1957 році Марвін Мінськ і прагне подолати деякі обмеження традиційних ширококутних мікроскопів флуоресценції. У звичайному (тобто широкого поля) флуоресцентний мікроскоп весь зразок затоплюються рівномірно світло від джерела світла. Всі частини зразка в оптичному шляху збуджуються в той же час і в результаті флуоресценції детектують за допомогою мікроскопа фотодетектора або камер, включаючи велику несфокусовану частину фону. На противагу цьому, конфокальний мікроскоп використовує точку підсвічування (див. функція розсіювання точки) і крихітний отвір в оптично сполученій площині передньої частини детектора, щоб виключити з фокусу сигналу - назва «конфокальної» походить від цієї конфігурації. Як тільки світло, що випромінюється за допомогою флуоресценції дуже близько до фокальної площини можна виявити, зображення в оптичній роздільній здатності , зокрема, у напрямку глибини зразка, набагато краще, ніж у широкого полі мікроскопів. Тим не менш, так як більша частина світла від зразка флуоресценції блокується на прокол, це підвищена роздільна здатність за рахунок зменшеної інтенсивності сигналу - так довго впливу часто потрібні. Щоб компенсувати це падіння сигналу після того, як прокол, інтенсивність світла виявляється за допомогою чутливого детектора, як правило, фотоелектронний помножувач (ФЕУ) або лавинним фотодіодом, перетворюючи світловий сигнал на електричний, який записується за допомогою комп'ютера.

Як тільки одна точка у зразку освітлена в той час, 2D або 3D зображень потрібно сканування над регулярною растра (тобто прямокутний шаблон паралельних ліній сканування) у зразку. Промінь сканують поперек зразка в горизонтальній площині за допомогою одного або більше (серво контролюється) дзеркала, що осцилюють. Цей метод сканування зазвичай має низьку реакційну затримку і швидкість сканування може змінюватися. Повільне сканування забезпечують краще відношення сигнал-шум, що призводить до кращої контрастності і більше високою роздільною здатністю.

Досяжна товщина фокальної площини визначається головним чином від довжини хвилі використовуваного світла, поділеної на числової апертури цього об'єктива, але і оптичних властивостей зразка. Тонкі оптичні секціонування можливо роблять ці типи мікроскопів особливо хороші у 3D візуалізації та профілюванні поверхні зразків.

Послідовні зрізи становлять «Z-стек», який може бути оброблений певним програмним забезпеченням для створення 3D-зображення, або він об'єднується в 2D стеку (переважно максимальна інтенсивність пікселя беруться, інші загальні методи включають використання стандартного відхилення або підсумовування пікселів).

Конфокальна мікроскопія забезпечує ємність для прямого, неінвазивного, серійного оптичного секціонування інтактних, товстих та живих особин з мінімумом підготовки проб, а також незначним покращенням у бічному дозволі. Біологічні зразки часто обробляють флуоресцентні барвники, щоб зробити вибрані об'єкти видимими. Однак фактична концентрація барвника може бути низькою, щоб звести до мінімуму порушення біологічних систем: деякі інструменти можуть відстежувати окремі флуоресцентні молекули. Крім того, трансгенні методи можуть створювати організми, які виробляють свої власні флуоресцентні молекули химерних (такі як сплав GFP, зеленого флуоресцентного білка з білком, що представляє інтерес). Конфокальні мікроскопи працюють за принципом точкового збудження у зразку (дифракції обмежено точкові) та виявлення точки флуоресцентного результуючого сигналу. Обскури на детекторі забезпечує фізичний бар'єр, який блокує поза фокусом флуоресценції. Тільки у фокусі, або центральної плями диска Ейрі, записується. Растрове сканування зразка в одній точці, в той час допускає тонкі оптичні ділянки повинні бути зібрані шляхом простої зміни Z-фокус. Отримані зображення можуть бути складені, щоб зробити 3D зображення зразка.

Методи, що використовуються для горизонтального сканування

Чотири типи конфокальних мікроскопів є комерційно доступними:

Конфокальні лазерні скануючі мікроскопи використовують декілька дзеркала (зазвичай 2 або 3 сканувань лінійно вздовж осей х і у-вісь) для сканування лазера на зразок та «descan» зображення через фіксовану обскуру та детектор.

Користь

CLSM широко використовується в багатьох біологічних наукових дисциплін, від клітинної біології та генетики в галузі мікробіології та біології розвитку. Він також використовується в квантової оптики та нано-кристалічної візуалізації та спектроскопії.

Біології та медицини

Приклад стоси конфокальної мікроскопії зображень, що показують розподіл актинових філаментів по всій клітині.

Клінічний, КЛСМ використовується при оцінці різних очних захворювань, і особливо корисно для отримання зображень, якісного аналізу та кількісної оцінки ендотеліальних клітин у рогівці. Він використовується для локалізації та ідентифікації присутності ниткоподібних елементів грибів у рогівковій стромі у випадках кератомійкози, що дозволяє швидко поставити діагноз і тим самим раннє заснування остаточної терапії. Дослідження CLSM методів для ендоскопічних процедур (ендомікроскопія) також показує обіцянку. У фармацевтичній промисловості було рекомендовано стежити за процесом виготовлення тонких фармацевтичних форм плівки, щоб контролювати якість та однорідність розподілу лікарського засобу.

Оптика та кристалографія

CLSM використовується як механізм пошуку даних у деяких оптичному зберіганні даних 3D-системах і допоміг визначити вік папірусу Магдалини.

Варіанти та удосконалення

Поліпшення осьового дозволу

Точка поширення функція точкового еліпсоїд, кілька разів до тих пір, як це широко. Це обмежує осьову роздільну здатність мікроскопа. Один з методів подолання цього 4 π мікроскопії , де світло, що падає і випромінюється або можуть заважати як зверху, так і знизу зразка, щоб зменшити обсяг еліпсоїда. Альтернативна методика конфокальної мікроскопії тета. У цій техніці конус освітлювального світла і детектується світло розташований під кутом один до одного ( найкращим результатамколи вони перпендикулярні). Перетин двох фор функцій дає набагато менший ефективний обсяг зразка. З цього еволюціонували одного літака підсвічування мікроскопа. Додатково деконволюції можуть бути використані з використанням експериментально отриманої функції розсіювання точки для видалення з фокусу світла, покращуючи контраст в обох осьових і бічних площинах.

Супер дозвіл

Є конфокальні варіанти, які досягають роздільної здатності нижче дифракційної межі, такі як стимульованої емісії збідненої мікроскопії (STED). Крім цієї техніки широке розмаїття інших методів (не конфокальної основі) супер-дозвіл доступні як пальмова, (д) ​​ШТОРМОВА, SIM - карти, і так далі. Всі вони мають свої переваги, такі як простота використання, дозвіл та необхідність спеціального обладнання, буфера або флуорофору.

Низькотемпературний Працездатність

Для зразків зображень при низьких температурах, два основних підходи були використані як на основі лазерної скануючої конфокальної мікроскопії архітектури. Один з підходів полягає у використанні безперервного потоку кріостату: тільки зразок знаходиться при низькій температурі та її оптичною адресацією через прозоре вікно. Інший можливий підхід полягає в частині оптики (особливо об'єктивного мікроскопа) у кріогенній судині Дьюара для зберігання. Цей другий підхід, хоч і більш громіздким, гарантує кращу механічну стабільність і дозволяє уникнути втрат через вікно.

зображень

Частковий профіль поверхні монети 1-Євро, виміряний за допомогою диска Нипкова конфокальної мікроскопії.

Відображення даних для 1-монети євро.

історія

Початок: 1940-1957

Перший конфокальний скануючиймікроскоп був побудований Marvin Мінськ в 1955 і патент був подано в 1957 році сканування точки освітлення у фокальній площині було досягнуто шляхом переміщення стадії. Жодне наукове видання не було представлено, і жодні зображення, зроблені з ним не були збережені.

Тандем-скануючий мікроскоп

Схема Тандем-скануючої мікроскопії Petran в. Червоний бар додано, щоб вказати Нипкова диск.

У 1960 році чехословацький Моймір Петран медичний факультет Карлового університету в Пльзені розробила Тандем скануючий мікроскоп, перший Комерціалізований конфокальної мікроскопії. Він був проданий невеликий компанії в Чехословаччині і в Сполучених Штатах Tracor-Північної (пізніше NORAN) і використовується обертовий диск Нипкова, щоб генерувати численні збудження та емісії мікроотворів.

Патент чехословацький був поданий у 1966 році за Петраном і Міланом Hadravský, чехословацьким колегою. Перша наукова публікація з даними та зображеннями, отриманими з цим мікроскопом, була опублікована в журналі Science у 1967 році, автором якого є М. Девід Еггер з Єльського університету та Petran. У примітці до цієї статті згадується, що Petran розроблений мікроскоп і керував його будівництвом, і що він був частково «науковим співробітником» в Єльському університеті. Друге видання з 1968 року описав теорію та технічні деталі приладу і мав Hadravský і Роберт Галамбос, керівник групи в Єльському університеті, як додаткові автори. У 1970 році було видано патент США. Він був поданий у 1967 році.

1969: Перший конфокальної лазерної скануючої мікроскопії

У 1969 і 1971 роках, М. Девід Egger і Пол Davidovits з Єльського університету, опублікував дві статті, що описують перший конфокальний лазерноїскануючої мікроскопії. Це була точка сканера, тобто тільки один освітлення плями було згенеровано. Він використовується епі-освітлення-відображення мікроскопії для спостереження нервової тканини. У 5 мВт гелій-неоновий лазер з довжиною хвилі 633 нм світло відбивалося від напівпрозорого дзеркала у напрямку мети. Ціль була простий об'єктив з фокусною відстанню 8,5 мм. На відміну від усіх попередніх і пізніших систем, зразок сканували рухом цієї лінзи (мета сканування), що призводить до переміщення фокальної точки. Відбите світло повернулося до напівпрозорого дзеркала, передана частина була орієнтована іншою лінзою на точкове виявлення, за якою фотоелектронний помножувач був поміщений. Сигнал візуалізували за допомогою ЕПТ осцилографа, електронно-променевий був перенесений одночасно з метою. Спеціальний пристрій дозволив зробити Polaroid фотографії, три з яких були показані в 1971 році публікації.

Автори розмірковують про флуоресцентні барвники для досліджень у природних умовах. Вони посилаються на патент Мінського, дякую Стів Бера, в той час докторант в Альберта Ейнштейна школи медицини в Нью - Йорку , де він розробив конфокальної лінії скануючого мікроскопа, що запропонував використовувати лазер з «мікроскопом Мінська» і подякувати Галамбос, Hadravsky і Petran для дискусій, які ведуть розвитку свого мікроскопа. Мотивація їх розвитку було те, що у Tandem-сканирующей мікроскопії лише фракція 10 -7 освітлювального світла бере участь у генерації зображення у частині ока. Таким чином, якість зображення не була достатньою для більшості біологічних досліджень.

1977-1985: Точкові сканери з лазерами та сканування сцени

У 1977 році Колін JR Sheppard і Tony Wilson описав конфокальної з епі-лазера-підсвічуванням, сканування стадії та фотоелектронних помножувачів як детектори. Етап міг переміщатися вздовж оптичної осі (Z-вісь), що дозволяє оптичні серійні зрізи.

У 1979 році Фред Brakenhoff та його колеги показали, що теоретичні переваги оптичного секціонування та покращення дозволу дійсно досяжно на практиці. У 1985 році ця група стала першою публікувати переконливі знімки, зроблені на конфокальній мікроскопії, які могли відповісти на біологічні питання. Незабаром після того, як багато більше груп почали використовувати конфокальні мікроскопії, щоб відповісти на наукові питання, які досі залишилося загадкою через технологічні обмеження.

У 1983 році IJ Cox унд С. Шеппард з Оксфорда опублікував першу роботу відповідно до якого конфокальний мікроскоп, керований комп'ютером. Перший комерційний лазерний мікроскоп, що сканує, етап-сканер SOM-25 був запропонований Oxford оптоелектроніки (після декількох TAKE-кадром, придбаних BioRad), починаючи з 1982 р. Вона була заснована на конструкції групи Oxford.

Починаючи з 1985 року: Лазерна точка сканери з скануванням променя

У середині 1980-х років, Вільям Бредшоу Амоса і Джона Грема Уайта та його колег, що працюють в лабораторії молекулярної біології в Кембриджі була побудована перша конфокальної променя скануючого мікроскопа. Стадії зі зразком не рухається, замість того, щоб освітленість пляма, що дозволяє швидше отримання зображень: чотири зображення за секунду з 512 рядків кожна. Сильно перебільшені проміжні зображення, - за шляхом променя довжиною 1-2 метрів, допускається використання звичайної ірисової діафрагми як «обскура», з діаметром ~ 1 мм. Перші мікрофотографії були прийняті при тривалому впливі на плівку, перш ніж було додано цифровий фотоапарат. Подальше вдосконалення дозволило масштабування на підготовку вперше. Цейсс приблизно в той же час привели до комерційного CLSM шведської компанії Зарастро~d. Підприємство було придбано 1990 року молекулярної динаміки, але зрештою CLSM припинено. У Німеччині, Heidelberg Instruments , заснована в 1984 році, розробив КЛСМ, який спочатку означало для промислового застосування, а не біології. Цей документ було передано у 1990 році Leica Lasertechnik. Цейсс вже не-конфокальної літаючої плями лазерного скануючого мікроскопа на ринку, який був підвищений до конфокальної. У доповіді 1990 року, зазначивши, «деякі» виробник confocals списків: Sarastro, технічний інструмент, Meridian Instruments, Bio-Rad, Leica, Tracor-північного та Цейс.

У 1989 році Фріц Карл Preikschat, із сином Ekhard Preikschat, винайшов скануючий лазерний діод мікроскоп для аналізу розміру частинок. Він і Ekhard Preikschat співзасновником Lasentec комерціалізувати. У 2001 році Lasentec було придбано Mettler Toledo (NYSE: МПД). Близько десяти тисяч систем були встановлені по всьому світу, в основному у фармацевтичній промисловості для забезпечення контролю у місці процесу кристалізації у великих системах очищення.

• Двофотонне збудження мікроскопія : Незважаючи на те, що вони використовують відповідну технологію (обидва лазерні мікроскопи, що сканують), багатофотонні флуоресцентні мікроскопи не є строго конфокальними мікроскопами. Термін конфокальноївиникає з-за наявності діафрагмив кон'югованої фокальної площини(Конфокального). Ця діафрагма зазвичай відсутня у багатофотонних мікроскопах.
• Повне внутрішнє відображення флуоресцентний мікроскоп (TIRF)
  конфокальної мікроскопії
  • Віртуальний CLSM (Java-основа)
  • анімація та роз'яснення з різних типів мікроскопів, включаючи флуоресцентні та конфокальні мікроскопи . (Université Paris Sud)

  

Конфокальна мікроскопія- один з сучасних методівдослідження; дозволяє проводити прижиттєвий моніторинг стану рогівки з візуалізацією тканин на клітинному та мікроструктурному рівні.

Даний метод через оригінальну конструкцію мікроскопа та його велику роздільну здатність дозволяє візуалізувати живі тканини рогівки, виміряти товщину кожного з її шарів, а також оцінити ступінь морфологічних порушень.

Охарактеризувати морфологічні зміни рогівки, що виникають при різних запальних та дистрофічних її захворюваннях, а також внаслідок хірургічних втручань та впливу КЛ.

Дані морфологічного дослідження необхідні, щоб оцінити тяжкість патологічного процесу, ефективність лікування та визначити тактику ведення хворого.

Показання

Запальні захворювання рогівки (кератити).
Дистрофічні захворювання рогівки (кератоконус, дистрофія Фукса та ін.).
Синдром "сухого ока".
Стан після хірургічних втручань на рогівці (наскрізної пересадки рогівки, кераторефракційних операцій).
Стани, пов'язані з носінням КЛ.

Протипоказання

Відносне протипоказання виражене подразнення ока на тлі гострого запального процесу.

Підготовка

Методика

Дослідження виконують на конфокальному мікроскопі ConfoScan 4 (Nider) із збільшенням у 500 разів. Прилад дозволяє оглянути рогівку по всій товщині.

Розмір досліджуваної зони становить 440×330 мкм, товщина шару сканування – 5 мкм. Лінзу з краплею гелю підводять до рогівки до торкання і встановлюють так. щоб товщина шару імерсійної рідини становила 2 мм. Конструкція приладу дозволяє досліджувати рогівку в центральній зоні та її парацентральних ділянках (рис. 7-1; рис. 7-2).

Інтерпретація

Нормальна морфологічна картина рогівки

Передній епітелій складається із 5-6 шарів клітин. Середня товщина всього епітелію – приблизно 50 мкм. За морфологічною структурою виділяють такі шари (зсередини назовні): банальний, шилоподібних клітин та поверхневий.

Самий внутрішній (базальний) шар представлений дрібними щільними циліндричними клітинами без видимого ядра. Кордони базальних клітин чіткі, яскраві (рис. 7-3).

Середній шар складається з 2-3 пластів шиповидних (крилатих) клітин із глибокими інвагінаціями, в які вбудовуються вирости сусідніх клітин. Мікроскопічно межі клітин досить добре помітні, а ядра можуть визначатися чи бути нечіткими (рис. 7-4).

Поверхневий шар епітелію представлений одним або двома пластами полігональних клітин з чіткими межами та гомогенною щільністю. Ядра зазвичай яскравіша, ніж цитоплазма, в якій також можна розрізнити навколоядерне темне кільце (рис. 7-5).

Серед клітин поверхневого шару розрізняють темні та світлі. Підвищена відбивна здатність епітеліальних клітин свідчить про зниження в них рівня метаболізму і десквамації, що починається.

Боуменова мембрана прозора структура, яка відбиває світло, у нормі при конфокальної мікроскопії її візуалізація неможлива.

Суббазальне нервове сплетення перебуває під боуменовою мембраною. У нормі нервові волокна виглядають як яскраві смуги, що паралельно йдуть на темному тлі, контактують між собою. Рефлективність (відбивна здатність) може бути нерівномірною протягом волокна (рис. 7-6).

Строма рогівкизаймає від 80 до 90% товщини рогівки і складається з клітинного та позаклітинного компонента. Основні клітинні елементи строми-кератоцити; становлять приблизно 5% обсягу.

Типова мікроскопічна картина строми включає кілька яскравих неправильних овальних форм тіл (ядер кератоцитів), які лежать у товщі прозорого темно-сірого або чорного матриксу. У нормі візуалізація позаклітинних структур неможлива через їхню прозорість. Строма може бути умовно поділена на субшари: передній (розташований безпосередньо під боуменовою мембраною та становить 10% товщини строми), переднесередній, середній та задній.

Середня щільність кератоцитів вища у передній стромі, поступово їх кількість зменшується у напрямку до задніх шарів. Щільність клітин передньої строми майже вдвічі більша, ніж клітин задньої строми (якщо щільність клітин передньої строми прийняти за 100%, то щільність клітин задньої становитиме близько 53,7%). У передній стромі ядра кератоцитів мають округлу бобоподібну форму, а в задній овальну і витягнуту (мал. 7-7.7-8).

Ядра кератоцитівможуть відрізнятися за яскравістю. Різна здатність відбивати світло залежить від їхнього метаболічного стану. Більш яскраві клітини прийнято вважати активованими кератоцитами (стресовими клітинами), діяльність яких спрямована на підтримку внутрішнього гомеостазу рогівки. У нормі та полі зору зустрічаються поодинокі активовані клітини (рис. 7-9).

Нервові волокна в передній стромі рогівки візуалізуються у вигляді яскравих гомогенних смуг, які нерідко утворюють біфуркації (рис. 7-10).

Десцеметова мембранав нормі прозора та не візуалізується при конфокальній мікроскопії.

Задній епітелій є моношаром гексагональних або полігональних плоских клітин з рівномірно світлою поверхнею на тлі точних темних міжклітинних кордонів (рис. 7-11).

У приладі закладено можливість мануального чи автоматичного підрахунку щільності клітин, їх площі та коефіцієнта варіабельності.

Патологічні зміни будови рогівки

Кератоконус характеризується значними змінами в передньому епітелії та стромі рогівки.

Передній епітелій. Виявляють різні варіанти епітеліопатії (рис. 7-12).

Вступ.

Конфокальний мікроскоп відрізняється від "класичного" оптичного мікроскопа (див. ) тим, що в кожний момент часу реєструється зображення однієї точки об'єкта, а повноцінне зображення будується шляхом сканування (руху зразка або перебудови оптичної системи). Для того, щоб реєструвати світло тільки від однієї точки після об'єктивної лінзи розташовується діафрагма малого розміру таким чином, що світло, що випромінюється аналізованою точкою (червоні промені на Рис. 1б), проходить через діафрагму і буде зареєстровано, а світло від інших точок (наприклад, сині промені на Рис. 1б) переважно затримується діафрагмою. Друга особливість полягає в тому, що освітлювач створює не рівномірну освітленість поля зору, а фокусує світло в аналізовану точку. (Рис. 1в). Це може досягатися розташуванням другої фокусуючої системи за зразком, але при цьому потрібно, щоб зразок був прозорим. Крім того, об'єктивні лінзи зазвичай порівняно дорогі, тому використання другої системи фокусування для підсвічування мало переважно. Альтернативою є використання світлоділильної пластинки, так щоб і падаюче і відбите світло фокусувалися одним об'єктивом (Рис. 1г). Така схема ще й полегшує юстування.

Рис. 1а. Хід променів у звичайному оптичному мікроскопі, коли фотоприймальний пристрій потрапляє світло з різних точок зразка.

Рис. 1б. Застосування діафрагми дозволяє суттєво знизити фонове підсвічування від точок зразка поза аналізованої області.

Рис. 1в. Додаткове підвищення контрасту досягається застосуванням підсвічування, що фокусує світло в аналізовану точку.

Рис. 1г. Схема зі світлодільній пластинкою спрощує конструкцію мікроскопа та процес юстування за рахунок подвійного використання об'єктива
(Для підсвічування та збору відбитого сигналу).

Дозвіл та контрастність у конфокальному мікроскопі.

Розглянемо тепер математично, як і наскільки кількісно змінюється контрастність при застосуванні конфокальної мікроскопії. По-перше, тому що в конфокальному мікроскопісвітло двічі проходить через об'єктив, то функція розмиття точки (далі позначається PSF, див. визначення в) має вигляд

Для якісного розуміння зручно розглядати кожну PSF як ймовірність того, що фотон потрапить у точку з координатами або що фотон буде зареєстрований з точки з координатами, тоді конфокальна PSFє твір незалежних імовірностей. на Рис. 2наведено зображення звичайної PSF та конфокальної PSF.

Рис. 2. Конфокальна PSF показана праворуч, а звичайна PSF – ліворуч.

Якщо використовувати критерій Релея для дозволу (провал 26% від максимуму розподілу), то ми отримаємо, що роздільна здатність у конфокальному мікроскопі збільшується, але не суттєво. Для конфокального мікроскопа

у той час як для звичайного мікроскопа

Проте основною перевагою конфокального мікроскопа є збільшення дозволу у сенсі критерію Релея, а істотне збільшення контрастності. Зокрема для звичайної PSF у фокальній площині відношення амплітуди в першому бічному максимумі до амплітуди в центрі становить 2%, для конфокального випадку мікроскопа це відношення буде 0.04%. на Рис. 3наведено практичний прикладколи це важливо. На верхній частині малюнка ми бачимо, що тьмяний об'єкт (інтенсивність у 200 разів менший, ніж у яскравого) неможливо виявити у звичайний мікроскоп, хоча відстань між об'єктами істотно більша за те, що передбачено критерієм Релея. У той же час, в конфокальний мікроскоп (нижня частина малюнка 3) даний об'єкт повинен добре реєструватися.

Рис. 3. Розподіл інтенсивності випадку звичайного мікроскопа (верхній малюнок) і конфокального мікроскопа (нижній малюнок).
Максимум інтенсивності тьмяного об'єкта в 200 разів менший, ніж інтенсивність яскравого [ 1 ].

Розподіл інтенсивності вздовж оптичної осі для конфокального мікроскопа визначається виразом

Тоді користуючись критерієм Релея отримаємо дозвіл уздовж оптичної осі

Тут важливо відзначити, що не слід плутати роздільну здатність уздовж оптичної осі та глибину фокусу у звичайному мікроскопі. Зазвичай глибина фокусу в сотні разів перевищує роздільну здатність уздовж оптичної осі.

Вплив діафрагми у фокальній площині.

Один з параметрів, який ніяк не фігурував у цьому описі - це розмір діафрагм у фокальній площині опромінює і збирає лінз. Зазначимо, що з аналізі ми мовчазно припускали джерело точковим і у цьому припущенні отримали функцію розмиття точки (PSF) для нормального і конфокального мікроскопа. Отримані PSF описують властивості об'єктивної лінзи, а зображення діафрагми у площині об'єкта визначає, світло з яких областей реєструється фотодетектором. Очевидно, однак, що зменшення розміру діафрагми призводить до зменшення кількості світла, що зникає, збільшує рівень шуму і, в кінцевому підсумку, може звести нанівець всі досягнуті переваги по контрастності. Таким чином, стоїть питання про оптимальний вибір розміру діафрагми та розумний компроміс.

Діафрагма з отвором меншою за розмір плями Ейрі просто призводить до втрати інтенсивності і ніяк не впливає на дозвіл. Діафрагма розміром в одну пляму Ейрі дозволяє максимально використовувати роздільну здатність об'єктивної лінзи. Однак розмір діафрагми приблизно в 3-5 рази більше плям Ейрі є найбільш підходящим компромісом. Слід розуміти, що розмір, що обговорюється тут, має сенс розміру зображення в площині об'єкта, а тому реальний розміротвори діафрагми залежить від збільшення лінзи. Зокрема, при використанні 100-кратної лінзи діафрагма з отвором 1 мм буде спроектована в площину об'єкта в коло радіусом 10 мкм.

Для того, щоб врахувати наявність діафрагми математично та побудувати нову функціюрозподілу інтенсивності, слід виконати пакунок

а конфокального мікроскопа вже отриману функцію множити на . Результуючий розподіл інтенсивності для випадку діафрагми розміром 5 плям Ейрі наведено на Рис. 4.

Конфокальна мікроскопія – це один із методів оптичної мікроскопії, який має суттєвий контрастом у порівнянні зі звичайними класичними мікроскопами. Відмінною особливістюданого методу є використання діафрагми, здатної відсікати потік розсіяного фонового світла.

У конфокальному мікроскопі у кожний час відбувається реєстрація зображення однієї струми об'єкта. Повноцінне зображення виходить за рахунок сканування пересування зразка або розбудови оптичної системи. Після об'єктивної лінзи розташована діафрагма невеликого розміру так, щоб світло, що випускається точкою, що досліджується, проходив через неї і реєструвався, а світло, що виходить від інших точок, затримувався діафрагмою.

Описаний метод дослідження дає змогу вивчати внутрішню структуру різних клітин. З його допомогою можна ідентифікувати окремі молекули та структури клітини, мікроорганізми, а також динамічні процеси, що протікають у клітинах.

Опис методу конфокальної мікроскопії

Завдяки конфокальній флуоресцентній мікроскопії з'явилася можливість отримувати тривимірне субмікронне розширення об'єктів, а також значно розширилася можливість проведення неруйнівного аналізу прозорих зразків. Завдяки використанню в зазначених мікроскопах як джерела світла лазерів, досягається підвищення їх роздільної здатності.

У порівнянні з ксеновими або ртутними лампами лазери відрізняються суттєвими перевагами, так як мають здатність монохроматичності, а також високої паралельності пучка світла, що випускається. Такі властивості лазерного випромінювання забезпечують оптичній системі ефективнішу роботу, а також знижують кількість відблисків і збільшують точність фокусування пучка світла.

На досліджуваному зразку лазер висвітлює в повному обсязі поле зору, а фокусується у певній точці. Конфокальна діафрагма дозволяє позбавитися позафокусної флуоресценції, при цьому змінюючи діаметр діафрагми, можна точно визначати товщину оптичного шару біля фокусу лазерного променя. Завдяки описаній властивості конфокальна мікроскопія дозволяє отримувати поліпшену роздільну здатність вздовж осі Z.

Спеціальні програми, якими оснащені конфокальні мікроскопи, дозволяють із серії оптичних зрізів створювати об'ємні зображення об'єктів, а також розглядати їх під різними кутами зору.

Застосування мультиспектрального лазерного конфокального скануючого мікроскопа дає можливість вивчати колоколізацію в клітині різних речовин. Мультиспектральний режим дозволяє проводити на конфокальному мікроскопі дослідження методом FISH.

Приклади досліджень, які проводяться за допомогою конфокального мікроскопа

Конфокальна мікроскопія допомагає вивчати здатність різних речовин накопичуватися в ядрі, цитоплазмі або інших клітинних структурах. Ці здібності найчастіше застосовують у процесі проведення досліджень механізмів дії канцерогенів, протипухлинних сполук, лікарських препаратів, і навіть дозволяють розраховувати їх ефективні концентрації.

Летальне вивчення інтенсивності, а також форми спектрів власної флуоресценції дає можливість розпізнавати запалені та нормальні клітини. Цей метод використовується на ранніх термінах діагностики раку шийки матки.

Правильно підібрана комбінація різних фільтрів, призначених для кількох типів власної флуоресценції, може виходити без трудомісткого дослідження множини зрізів. Таким чином, можна швидко та точно виявляти злоякісні тканинні структури та відрізняти їх від нормальних.

Методи конфокальної мікроскопії досить широко використовуються в гідробіології та ембріології, в ботаніці та зоології у процесі вивчення структури гамет, а також розвитку та формування організмів.

Конфокальні лазерні мікроскопи в сучасному світізнайшли широке застосування в галузі біології, біофізики, медицини, клітинної та молекулярної біології. Конфокальна мікроскопія – унікальна безконтактна методика, яка сьогодні використовується для вивчення рогівки ока. Вона дозволяє максимально точно оцінити наявний ступінь клітинних змін та позаклітинних структур, а також зробити висновки про можливе пошкодження рогівки загалом.

Лазерні конфокальні мікроскопи мають високу роздільну здатність, тому дозволяють досліджувати структуру флуоресцентно мічених клітин і навіть окремих генів. Застосування різноманітних технологій специфічного багатобарвного флуоресцентного забарвлення для біологічно активних молекул, а також надмолекулярних комплексів дає можливість вивчати складні механізми функціонування не лише окремих клітин, а й цілих систем. Ця технологіяшироко використовується в експериментальній біології, а також у медицині.

Устаткування - конфокальні мікроскопи

Сучасні надточні конфокальні мікроскопи, такі як Leica TCS SP8, дозволяють отримати максимально чіткі та достовірні дані при проведенні різних досліджень. Широкий інтерес до таких приладів виник у вісімдесятих роках минулого століття через швидкий розвиток комп'ютерної техніки та лазерних технологій.

Конфокальна лазерна скануюча мікроскопія є різновидом оптичної мікроскопії. Її особливістю є те, що лазерний промінь фокусується на певну область по осях Х і У і формує таким чином зображення. Відбите світло демонструється на екрані у вигляді растру. Розміри зображення безпосередньо залежать від роздільної здатності сучасної електроніки, а також від розмірів сканованого растру.

Вимірювальні прилади, які створені за допомогою сучасного методу конфокальної лазерної мікроскопії, що сканує, в наш час набули найширшого поширення в різних сферах. У порівнянні зі звичайною світловою мікроскопією конфокальна мікроскопія має такі переваги:

• покращена роздільна здатність;
• висока контрастність зображення;
• можливість проводити мультиспектральні дослідження з високим ступенем поділу сигналів;
• можливість отримання «оптичних зрізів» із тривимірною реконструкцією;
• можливості використання способів цифрової обробки отриманих зображень;

З недоліків описаної апаратури можна виділити:

• складність налаштування приладу;
• відсутність оптичного зображення;
• висока вартістьприладів, а також дорожнеча їх обслуговування.

У конфокальному мікроскопі для керування всією системою використовується спеціальний комп'ютер. Він дозволяє зберігати зображення та детально вивчати отримані дані. Для якісної обробки отриманих зображень часто потрібні досить великі обчислювальні потужності, тому комп'ютер повинен мати досить велику оперативну пам'ять. Для подальшого зберігання інформації потрібна також велика дискова пам'ять. Для передачі зображень комп'ютер повинен мати USB-порт або CD/DVDRW. Також комп'ютер має можливість підключення до глобальної інтернетабо локальної мережі.

Програмне забезпечення, встановлене на таких комп'ютерах, може бути базовим. Воно поставляється разом із технікою і дозволяє керувати всією системою та контролювати її основні функції. Також для вказаних комп'ютерів спеціально розробляються пакети прикладних завдань, які додатково замовляються. Багато моделей конфокальних мікроскопів мають спеціальний пульт управління, що дозволяє налаштовувати їхню роботу дистанційно.

Встановлюють описані прилади у звичайних лабораторних відвідин. Найважливішою процедурою в процесі експлуатації конфокальних мікроскопів є контроль за вібраціями. Для таких цілей застосовують спеціальний пристрій, що вимірює рівень вібрації. Процедура контролю схожа на процедуру вимірювання аксіальної роздільної здатності ЛСКМ за допомогою дзеркала.

Конфокальна мікроскопія швидко розвивається. Відомі компанії-виробники репрезентують на ринку новітні зразки конфокальних мікроскопів, які дозволяють ефективно розділяти лазерний промінь збудження, а також люмінесценцію. За допомогою комп'ютера в таких приладах керується світлодільник. Його спектральні властивості за необхідності можуть досить швидко перебудовуватись на кілька лазерних ліній.

Конфокальні мікроскопи у мікробіології

Конфокальний мікроскоп також незамінний у біології для детального дослідження клітини. Сьогодні на цю тему публікується безліч різних наукових статей. Найчастіше з допомогою конфокальних мікроскопів вивчають структуру клітин, і навіть їх органоїдів. Також досліджується колокалізація в клітині для того, щоб зрозуміти, чи є причинно-наслідковий зв'язок між речовинами клітини.

Під час вивчення білків конфокальними мікросокпами вони попередньо маркуються антитілами з різними флуорохромами. За допомогою звичайного класичного мікроскопа досить важко розібрати, чи розташовані вони поруч або один під одним, а от конфокальний мікроскоп дозволяє це зробити без особливих проблем. У пам'яті комп'ютера записуються дані про серію оптичних зрізів і, таким чином, проводиться об'ємна реконструкція об'єкта, а також виходить його тривимірне зображення.

Також за допомогою конфокальних мікроскопів досліджують динамічні процеси, що протікають у живих клітинах, наприклад, пересування іонів кальцію або інших речовин крізь клітинні мембрани. Використовують конфокальні мікроскопи для вивчення рухливості біоорганічних молекул за допомогою іонізації фотохімічного розкладання флуорохрому в зоні опромінення, а також подальшого його роз'єднання з молекулами. Такі молекули маркуються двома флуорохромами, які мають спектр випускання донора, який перекривається спектром поглинання акцептора. Таким чином, енергія передається від донора до акцептора на невеликих відстаняхта в результаті резонансу між енергетичними рівнями. Після цього акцептор у видимій ділянці спектра випромінює енергію, яка згодом реєструється за допомогою конфокального мікроскопа.

Розвиток конфокальної мікроскопії продовжується. Компанії-виробники зазначеного обладнання щорічно представляють на ринку все більш сучасні, функціональні та вдосконалені мікроскопи, що дозволяють вченим робити нові корисні відкриття в різних сферах. Удосконалюється і програмне забезпечення, призначене для комп'ютерів, які мають конфокальні мікроскопи. Воно дозволяє втілювати у життя найскладніші завдання, які дозволяють проводити дослідження на молекулярному і клітинному рівні. Сьогодні з упевненістю можна сказати, що за конфокальними мікроскопами майбутнє, оскільки за своїми функціональними характеристиками та технічними можливостями вони суттєво перевершили звичайні мікроскопи. Серед досить широкого асортименту оптичної контурної апаратури кожен користувач зможе підібрати для себе саме торт мікроскоп, який дозволить йому активно розвивати свої дослідження.

У цій книзі в короткій формі викладено матеріал, необхідний для освоєння сучасних конфокальних методів. лазерної мікроскопії. Частина з описаних у тексті практичних прийомів розроблена та вдосконалена авторами видання. Відмінною особливістю цієї книги є поєднання ключових моментів з теорії сучасних методів мікроскопії з прикладами використання різних прийомів конфокальної мікроскопії та імуноцитохімії на практиці. У додатках наводяться необхідні відомості про спектральні характеристики флуорохромів та протоколи імуноцитохімічних реакцій, використаних авторами для отримання зображень препаратів та побудови тривимірних реконструкцій мікроскопічних об'єктів. Даний посібник може бути довідковим посібником для фахівців, які використовують у своїй роботі флуоресцентні методи та конфокальну мікроскопію, а також буде корисним для студентів біологічних та медичних факультетів, які вивчають морфологічні та нейробіологічні дисципліни.

* * *

компанією ЛітРес.

ФЛУОРЕСЦЕНТНА МІКРОСКОПІЯ І КОНФОКАЛЬНА ЛАЗЕРНА МІКРОСКОПІЯ – ПРИНЦИПИ ТА ОСНОВНІ МЕТОДИ

Більшість біологічних об'єктів мають низький контрастом внутрішніх структур, які в основному прозорі, тому можливості їх спостереження методом класичної мікроскопії світлого поля обмежені. Ця проблема може бути подолана декількома шляхами: застосуванням методу дослідження в темному полі, використанням методу фазового розмаїття, для двопроменевих матеріалів застосовують поляризаційний контраст. Основним методом контрастування в біології є фарбування препаратів речовинами, здатними зв'язуватися з препаратом і поглинати світло або флуоресцировать. Останні називають флуорохром.

1.1. Основні поняття

Флуорохроми (флуоресцентні барвники)1 – це речовини, які здатні зв'язуватися з об'єктом та витрачати частину енергії поглиненого світла на флуоресценцію. Під флуоресценцією розуміють здатність низки речовин після поглинання світла з однією довжиною хвилі випромінювати світло з іншого довжиною хвилі. Нагадаємо, що електрони в атомах розташовані на енергетичних рівнях; відстань між рівнями є характеристикою молекули. При опроміненні речовини світлом можливий перехід електронів більш високий енергетичний рівень. Різниця енергії між енергетичними рівнями та частота коливань поглиненого світла пов'язані між собою рівнянням Бору (постулат Бору):

де Δ Е- Різниця енергій між рівнями; v- Частота; λ – довжина хвилі; h- Постійна Планка; з- швидкість світла.

Після поглинання світла частина отриманої системою енергії витрачається у вигляді тепла, частина може бути випромінювана у вигляді фотона. Згідно з правилом Стокса, довжина хвилі світла, що випускається більше, ніж довжина хвилі поглинається, або, іншими словами, максимум спектра випромінювання зрушений по відношенню до максимуму спектра поглинання в бік більш довгих хвиль. З фізичними основами описаних вище процесів докладніше можна ознайомитись у підручнику Р. Фейнмана (2011).

Кожен флуорохром характеризується певним спектром поглинання та випромінювання.Наприклад, один із найпоширеніших флуоресцентних барвників – FITC (fluorescein-5-isothiocyanate) – має максимум поглинання l ex= 492 нм, а максимум випромінювання для нього становить l em= 518 нм. Інший поширений флуорохром, 5-TAMRA (5-carboxytetramethylrhodamine), має l ex= 543 нм та l em= 570 нм. На величину стоксового зсуву також впливає полярність середовища, в якому знаходиться флуорохром.

Найбільш інтенсивної флуоресценції флуорохрому можна домогтися, опромінюючи його світлом з довжиною хвилі, близькою до максимуму поглинання, проте можливо перевести флуорофор у збуджений стан і при опроміненні його світлом з довжиною хвилі, що істотно відрізняється від максимуму його поглинання. Наприклад, флуорофор можна перевести у збуджений стан двома або трьома довгохвильовими фотонами (мультифотонне збудження), що буде еквівалентно збудженню одним короткохвильовим фотоном. Так, збудження двома або трьома фотонами з довжиною хвилі 900 нм еквівалентно збудженню одним фотоном з довжиною хвилі 450 або 300 нм.

Ще однією характеристикою флуорохрому є квантовий вихід- Відношення інтенсивності поглинається і світла, що випускається. Квантовий вихід ( Q) може бути виражений через відношення інтенсивності флуоресценції ( F) до різниці інтенсивностей падаючого ( I 0) і виходить ( I) світлових потоків:

Зауважимо, що квантовий вихід завжди менше одиниці через «стоксівські» втрати. Залежно від квантового виходу флуорохроми поділяють на слабкі та сильні. Сучасні синтетичні флуорохроми, як правило, мають високий квантовий вихід і є сильними.

Для характеристики можливості флуорохрому поглинати світло певної довжини хвилі вводять поняття молярного коефіцієнта екстинкції,який визначається як оптична щільність одномолярного розчину речовини при товщині світлопоглинаюче-

го шару в 1 см. Молярний коефіцієнт поглинання має розмірність л ⋅ моль - 1 ⋅ см - 1 . Він залежить від природи речовини і від довжини хвилі світла, що проходить. Розмір, отримана шляхом перемноження молярного коефіцієнта екстинкції на величину квантового виходу, характеризує яскравість флуоресценції флуорохрома при заданій довжині хвилі. Час опромінення, коли флуорохром втрачає 50 % яскравості, називають фотостабільністю. «Ідеальний» флуорохром повинен мати високий квантовий вихід та хорошу фотостабільність. Сучасні флуорохроми на основі напівпровідникових нанокристалів (квантових точок) за цими показниками на порядок перевершують органічні сполуки (Олійников В. А., 2011).

Ще один важливий параметр - час життя збудженого станущо визначається як середній час знаходження молекули у збудженому стані до того, як повернутися в основний стан. Час загасання флуоресценції флуорохрому (τ) описується формулою:

де Г – константа швидкості випромінювальної дезактивації флуорофору; k- Узагальнена константа швидкості безвипромінювальної дезактивації.

Зазвичай час загасання флуоресценції становить близько 10 нс.

Гасінням флуоресценціїназивають будь-які процеси, які зменшують інтенсивність флуоресценції цієї речовини. До гасіння може призводити безліч процесів: хімічні реакції у збудженому стані, перенесення енергії, утворення комплексів, гасіння при зіткненнях. До гасіння флуоресценції відносяться також процеси гасіння, яке здається оптичними властивостями зразка (висока оптична щільність, каламутність). Для гасіння флуоресценції потрібен контакт між молекулами флуорохрому та гасителя. Якщо гаситель дифундує до флуорохрому, поки останній перебуває у збудженому стані, і в результаті контакту флуорохром повертається в основний стан без випромінювання фотона, говорять про динамічне гасіння. Статичне гасіння відбувається при утворенні нефлуоресціюючого комплексу між флуорохромом та гасителем. При збільшенні концентрації флуорохрому можливе самогасіння флуоресценції як наслідок поглинання молекулами речовини власного випромінювання. Можливе також поглинання флуоресцентного випромінювання одного флуорохрому іншим. До гасителів флуоресценції відносять молекулярний кисень, ароматичні та аліфатичні аміни, ксенон, пероксид водню, акриламід, оксид азоту, нітрометан, нітроксиди, хлороформ, трихлоретанол, бромбензол. Слід зазначити, що не всі флуорохроми гасять будь-якими з перелічених вище речовин, проте (залежно від умов експерименту) майже завжди можна підібрати ефективну пару флуорохром-гасник або, навпаки, уникнути гасіння флуоресценції (що більш важливо в морфологічних дослідженнях).

Для флуорохромів характерна анізотропія флуоресценції. Анізотропія – це залежність властивостей речовини напряму. При збудженні поляризованим світлом селективно збуджуються ті молекули флуорохрому, для яких дипольний моментпереходу при поглинанні паралельний електричному вектору збуджуючого випромінювання. Таке селективне порушення частково орієнтованого набору флуорохромів призводить до частково поляризованого випромінювання флуоресценції. У загальному випадку анізотропія флуоресценції rвиражається формулою:

де Ivі Ih– інтенсивності флуоресценції вертикально та горизонтально поляризованого випромінювання у разі порушення зразка вертикально поляризованим світлом.

При плануванні експериментів з використанням флуорохромів, особливо флуорохромів нового покоління – квантових точок – необхідно враховувати можливість мерехтіння флуоресценції.Це стохастичний процес переходу флуорохрому з флуоресцентного стану у стан відсутності флуоресценції, незважаючи на постійне збудження. В результаті, при спостереженні за одиночними комплексами флуоресцирующими виникає стробоскопічний ефект (зорова ілюзія нерухомості або уявного руху предмета при його переривчастому спостереженні). Крім того, оскільки час знаходження флуорохрому у «включеному» та «вимкненому» стані є випадковим, порівняння результатів незалежних експериментів при використанні таких флуорохромів утруднено. При конфокальній мікроскопії цей ефект може бути компенсований за рахунок лінійного або покадрового усереднення зображень, що скануються.

1.2. Пристрій флуоресцентного мікроскопа

Прототип флуоресцентного мікроскопа було розроблено на початку ХХ ст. Августом Келлером, який при конструюванні мікроскопа використовував як джерело світла дугову кадмієву лампу. Потім німецький фізик Генрі Фрідріх Зідентофф, працюючи в оптичних майстернях Цейса (1907 – 1938 рр. директор лабораторії мікроскопії), спільно з Ріхардом Зігмонді винайшов (1903) щілинний ультрамікроскоп. Ще через вісім років (1911) Oskar Heimstдdt сконструював перший флуоресцентний мікроскоп і застосував його для дослідження явища автофлуоресценції органічних та неорганічних об'єктів. Однак у той час було важко досягти ефективного поділу флуоресцентного сигналу від збуджуючого світла. Ця проблема була подолана Philipp Ellinger та August Hirt у 1929 р., яким вдалося розробити так званий епіфлуоресцентний мікроскоп. У запропонованій ними конфігурації мікроскопа освітлення препарату і детекція флуоресцентного сигналу здійснювалася з одного боку від зразка, тому об'єктив досягав тільки відбитий збуджуючий і випромінюваний світло. Прорив у розвитку флуоресцентної мікроскопії пов'язаний з появою лазерів (60-ті рр. XX ст.), за допомогою яких вдалося досягти високого ступеня просторової та тимчасової когерентності світлового пучка. Крім того, стало можливим ефективно розділяти сигнали, використовуючи дихроїчні дзеркала.

p align="justify"> Принципова схема сучасного флуоресцентного мікроскопа представлена ​​на рис. 1.

Світло джерела проходить через фільтр збуджуючого випромінювання. При цьому із спектру виділяються ті компоненти, які необхідні збудження флуоресценції. Потім світло потрапляє на дихроїчне дзеркало (світлодільник). Відбите світлодільником світло потрапляє в об'єктив флуоресцентного мікроскопа і фокусується на зразку, збуджуючи флуоресценцію. Флуоресцентний сигнал (зміщений у довгохвильову область (відповідно до Правилу Стокса) ) , а також розсіяне випромінювання збудження досягає світлодільника, але, на відміну від збуджуючого світла, проходить через дихроічне дзеркало, після чого розсіяне випромінювання відсівається емісійним фільтром і на детектор потрапляє лише випромінювання флуоресценції.

Джерело збуджуючого світла.В даний час використовуються три типи джерел світла: лампи високої потужності (ртутні, ксенонові та їх аналоги), діоди та лазери. Ртутна лампа - це газорозрядне джерело світла, в якому при електричному розряді в парах ртуті під високим тиском виникає оптичне випромінювання переважно в ультрафіолетовій області спектра. Такі джерела світла є малоефективними, оскільки вони виробляють велику кількість надлишкової теплової та світлової енергії порівняно з енергією, яка потрібна для збудження флуоресценції. Флуоресцентні мікроскопи можуть бути укомплектовані ртутними лампами потужністю 50 - 200 W. Використання потужнішої лампи дозволяє збудити з достатньою ефективністю навіть слабкий флуорохром, але при цьому необхідно враховувати, що збільшення потужності лампи тягне за собою збільшення швидкості вигоряння флуорохромів.

Рис. 1.Принципова схема флуоресцентного мікроскопа

У ксеноновій лампі спалах відбувається після іонізації газу і проходження через нього потужного імпульсу електричного струму, поданого на електрод, що підпалює. Внаслідок цього електрони в молекулі ксенону займають орбіти з вищими енергетичними рівнями і, повертаючись на колишні орбіти, випромінюють енергію у вигляді фотонів. Ксенонова лампа має безперервний спектр випромінювання у широкому спектральному діапазоні, що не завжди придатне для збудження флуоресценції. Такі лампи зазвичай використовують при роботі з флуорохромами, що вимагають для збудження довгохвильового світла (червоної та інфрачервоної області).

Замість ртутної або ксенонової лампи можна використовувати металогалогенні лампи ( metal halide lamp). Це газорозрядна лампа високого тиску. Усередині колби розміщується кварцовий або керамічний циліндричний пальник, в якому знаходяться галогеніди деяких металів (йодиди натрію, талію, індія та ін.), інертний газ (переважно ксенон та аргон) та металева ртуть. При подачі на лампу напруги живлення відбувається запалення дугового розряду, метал починає випаровуватися, його атоми збуджуються, що призводить до виникнення випромінювання. Залежно від складу металів різняться спектри випромінювання ламп. Зазвичай компоненти підбираються так, щоб компенсувати нестачу червоного і жовтого світла в спектрі ртуті, що важливо при використанні флуорохромів, що збуджуються світлом цього діапазону (наприклад, флуоресцеїну). Крім цього, лампи цього типу компактні, економічні у використанні, для них характерний знижений рівень теплової віддачі.

Джерело порушення флуоресцентного випромінювання може бути виконаний у вигляді одного або декількох світловипромінюючих діодів, причому можливе використання діодів, що мають як однакову довжину хвилі випромінювання, так і різну. Застосування світлодіодів дозволяє уникнути нагрівання системи, збільшує термін експлуатації.

Лазери як джерело світла використовуються в основному в скануючих пристроях для забезпечення високої інтенсивності освітлення у вузькій спектральній області та на малій площі зразка. У таких мікроскопах гострофокусовані світлові промені лазера сканують зразок крапку за точкою. Оскільки лазери випромінюють світло у вузькій спектральній області, пропадає необхідність застосування збуджуючих світлофільтрів. Однак при використанні флуорохромів, які збуджуються на різних довжинах хвиль, потрібно застосовувати різні лазери або вдаватися до різноманітних прийомів.

Фільтри.

Фільтр збудливого світлапідбирається таким чином, щоб він виділяв зі спектру лампи світло тієї довжини хвилі, яка максимально ефективно поглинається флуорохромом. Наприклад, випускаються світлофільтри під стандартні флуорохроми для "синьої", "зеленої", "червоної" люмінесценції або під кілька стандартних флуорохромів (наприклад, збуджуючий світлофільтр BP 560/40 нм для "червоної" люмінесценції або збуджуючий світлофільтр під кілька флуорохромів) , BP 474/28, BP 585/35 нм виробництва компанії Carl Zeiss).

Дихроїчні дзеркала (інтерференційні світлофільтри)мають спеціальне інтерференційне покриття, що дозволяє відображати світло, довжина хвилі якого менше певного значення, і пропускати випромінювання з більшою довжиною хвилі. У даному випадкузбудливе випромінювання відбивається, а сигнал флуоресценції повністю пропускається. Для отримання таких фільтрів на поверхню прозорої пластини наносять кілька (від 10 до 200) шарів матеріалу з високим і низьким показниками заломлення, що чергуються. Наприклад, PbCl2, TiO2, ZnS (показник 2,2 – 2,3) та MgF 2 , SiO 2 , Na 3 AlF 6 (показник 1,3 – 1,4). Товщина кожного шару ретельно витримується (використовується техніка вакуумного напилення), оскільки цей параметр визначає положення максимуму кривої пропускання. Від числа шарів залежить ширина зони пропускання фільтра і рівень придушення «непотрібної» частини спектра.

Замикаючі фільтри(Band pass BP). При конструюванні замикаючих фільтрів використовують комбінацію довгохвильових фільтрів, що відрізають (shot pass filter, або SP filter) і довгохвильових пропускають (long pass filter, або LP filter). Перші затримують довгохвильове світло, але пропускають короткохвильове, а LP-фільтри, навпаки, пропускають довгохвильове світло, затримуючи короткохвильове. Комбінуючи ці фільтри, можна досягти того, що через фільтр буде проходити тільки світло певної ділянки спектра. Замикаючий фільтр вибирають відповідно до фільтра збудливого світла. Наприклад, при встановленні збуджуючого світлофільтра BP 560/40 нм використовують замикаючий світлофільтр BP 630/75 нм.

Зближення у просторі всіх світлофільтрів дозволило об'єднати їх у єдиний світлодільний модуль. Така конструкція забезпечує виробництво легкої заміни або зміни модуля і дозволяє застосовувати кілька флуорохромів одночасно, з високою точністю поєднуючи отримані зображення. При придбанні флуоресцентного мікроскопа необхідно серйозно підходити до питання про вибір світлодільних модулів, зважаючи на поставлені завдання та спектральні характеристики наявних флуорохромів. Якщо планується використовувати кілька флуоресцентних барвників, слід враховувати, що спектри випромінювання флуорохромів не повинні перекриватися. В іншому випадку можливі помилки в інтерпретації даних.

Детектори флуоресцентного сигналуПосилення та детектування сигналу здійснюється за допомогою фотоелектронного помножувача(ФЕУ) та цифрової відеокамери. ФЕУ - це електровакуумний прилад, в якому потік електронів, що випромінюється фотокатодом, посилюється в системі помноження в результаті вторинної електронної емісії. В результаті фотоефекту при попаданні фотона на фотокатод з нього вилітають електрони, які, прискорюючись в електричному полі, спрямовуються на систему динодів (спеціальний електрод), де за рахунок вторинної електронної емісії утворюють електронну лавину, що наростає (від динода до динода), що надходить на анод. Зазвичай коефіцієнт посилення ФЕУ (число електронів, що досягли анода при вибиванні з фотокатода одного електрона) становить близько 10 6 що дозволяє отримати на виході ФЕУ легко реєстрований сигнал.

Цифрові камерияк світлочутливий елемент мають CCD-матрицю (charge-coupled device), вона ж ПЗЗ-матриця (скор. від «прилад із зарядовим зв'язком»). CCD-матриця є спеціалізованою інтегральною аналоговою мікросхемою, яка є набір резисторів. Кількість цих осередків (елементів) у матриці є основною визначальною роздільною здатністю та якістю картинки. Принцип роботи CCD-матриці наступний: світло, що потрапило на матричні елементи, перетворюється на електричний зарядформується зарядова картина, яка пропорційна освітленості в кожному осередку. Матриця може «накопичувати» заряди протягом певного періодучасу. Загальний заряд, накопичений в осередку, дорівнює добутку зарядів на час експонування. Для отримання кольорової картинки, як правило, світловий промінь ще проходить через набір спеціальних світлофільтрів/призм зеленого, синього та червоного кольорів. З більш докладним описомпринципів роботи окремих модулівфлуоресцентного мікроскопа можна ознайомитись у посібнику В. І. Голишевської [та ін.] (2008) та у роботі H. C. Ishikawa-Ankerhold (2012).

1.3. Принципи конфокальної мікроскопії

Конфокальна мікроскопія є різновидом флуоресцентної мікроскопії з покращеною роздільною здатністю вздовж оптичної осі об'єктива, яка досягається за рахунок використання принципу конфокальної фільтрації флуоресценції. Концепцію конфокальної мікроскопії було запропоновано Marvin Minsky у 50-ті роки. XX ст. для дослідження тканини мозку без попереднього фарбування. У розробленому ним мікроскопі світло послідовно фокусувалося на різних точках зразка. З метою усунення шумового сигналу від ділянок, розташованих поза площиною фокусу, використовувалась діафрагма. Вона знаходилася в площині, пов'язаній з площиною фокусу об'єктива, таким чином, що при проектуванні діафрагми на об'єкт її зображення точно збіглося з фокусом світла, що освітлює об'єкт. При такому пристрої системи світло з областей поза фокусом затримувалося діафрагмою і на детектор потрапляло лише сигнал з фокусу об'єктива. Змінюючи діаметр діафрагми, можна було варіювати товщину оптичного шару поблизу фокусу об'єктива, від якого вимірювався сигнал. Сканування площини зразка за точками дозволяло отримати повне зображення. Виходячи з цього принципу, виникла і назва методу - "конфокальний" - заснований на поєднанні фокусів. Однак при такому пристрої мікроскопа на зображенні було занадто багато перешкод через слабкі джерела освітлення. Ймовірно, тому винахід Minsky залишився майже без уваги. Інтерес до нього повернувся лише після винаходу лазера. Докладніше історичні аспекти створення конфокального мікроскопа наведено в огляді Н. Н. Лукашової [та ін.] (2008).

У сучасному конфокальному мікроскопі джерелом збудливого світла лазер. Перевагою лазерів у порівнянні з ламповими джерелами світла полягає в монохроматичності світла, що генерується, і малої розбіжності світлового пучка. Монохроматичність збуджуючого флуоресценції світла дає можливість розширити спектральний діапазон флуоресценції, що реєструється, і поліпшити придушення світлорозсіювання на довжині хвилі збудження. Мала розбіжність пучка світла сприяє більш ефективну роботу оптичної системи мікроскопа, зменшує кількість відблисків, пов'язаних з відхиленням світла від розрахункового оптичного шляху, покращує точність фокусування пучка світла і зменшує обсяг, який можна сфокусувати світло на зразку. На рис. 2 показано принципову схему сучасного лазерного конфокального мікроскопа.

Лазер випромінює світло, утворюючи вузький світловий пучок. Потім світло проходить через систему лінз (розширювач пучка) і потрапляє на світлодільник, який відображає збуджуючий світло, спрямовуючи його на систему дзеркал (на схемі не показано), що дозволяють змінювати напрямок променя у взаємно перпендикулярних площинах. Світлодільник забезпечує високоефективне відображення світла на довжині хвилі генерації лазера та майже стовідсоткове пропускання світла в іншому спектральному діапазоні. Далі світло через об'єктив фокусується у певній точці зразка, збуджуючи флуоресценцію. При цьому лазерний промінь може збуджувати флуоресценцію у всіх шарах зразка, через які він проходить, а інтенсивність флуоресценції зростатиме з наближенням до точки фокусування. Флуоресцентне випромінювання збирається об'єктивом і повертається на світлодільник, проходить крізь нього, потрапляючи на емісійні фільтри. Відбите випромінювання лазера через світлодільник не проходить. При необхідності багатоканальної реєстрації (наприклад, при використанні кількох флуорохромів) можливий додатковий поділ флуоресцентного сигналу на складові за допомогою додаткових світлодільників та фільтрів емісії. Зібране з певної точки зразка світло фокусується у площині конфокальної діафрагми (pinhole), потрапляє на детектор (ФЕУ) та оцифровується. При цьому світло, що виходить з областей, що знаходяться вище або нижче за площину фокусу, відсікається діафрагмою і на детектор не потрапляє. Після реєстрації флуоресцентного сигналу від першої точки фокусування за допомогою системи дзеркал промінь збуджуючого світла переміщається на наступну точку зразка. Весь процес повторюється. Так, точка за точкою, формується зображення у горизонтальній (або вертикальній) площині.

Рис. 2.Принципова схема найпростішого конфокального мікроскопа

Діаметр конфокальної діафрагми можна варіювати, змінюючи товщину оптичного шару, від якого реєструється сигнал. Однак слід розуміти, що зменшення діаметра конфокальної діафрагми (а, отже, і зменшення товщини оптичного шару) призводить до зниження інтенсивності світла, яке пропускає діафрагма до детектора і, відповідно погіршенню детекції об'єктів з неяскравою флуоресценцією. У зв'язку з цим доводиться шукати компроміс між дозволом на осі. z, що залежить від розміру конфокальної діафрагми, і можливістю реєстрації чітких флуоресціюючих об'єктів, що залежить як від розміру діафрагми, так і від ступеня посилення сигналу, що реєструється.

Крім діаметра конфокальної діафрагми, товщина оптичного шару залежить від довжини хвилі збудливого світла, числової апертури об'єктива, показника заломлення імерсійного середовища. Зокрема, що більше числова апертура об'єктива, то менше товщина оптичного шару.

Не менш важливим параметром є роздільна здатність мікроскопа. Внаслідок дифракції світла збільшене зображення об'єкта може бути розмитим (дві або більше точок об'єкта сприймаються оком як одна). Ще XIX в. Джон Релей сформулював принцип, відповідно до якого гранична роздільна здатність мікроскопа не може бути більше половини довжини хвилі світла, що висвітлює об'єкт. Межа дозволу об'єктива мікроскопа (l min) була уточнена німецьким фізиком Г. Гельмгольцем:

l min = 0,61λ/ n sin α,

де -довжина хвилі світла; n- Показник заломлення імерсійного середовища; -апертурний кут (максимальний кут, який утворюють промені, що потрапляють в об'єктив, з оптичною віссю системи).

Вираз NА = n sin α називають числовою апертурою.

Згідно з формулою Гельмгольця, роздільна здатність об'єктива мікроскопа залежить від довжини хвилі опромінюючого світла і пропорційно числової апертури. Підвищити роздільну здатність також можна за допомогою збільшення коефіцієнта заломлення імерсійного середовища. Оскільки неможливо необмежено зменшувати довжину хвилі опромінюючого світла і збільшувати числову апертуру об'єктива, існує межа, що дозволяє, - близько 200 нм. Однак є можливість покращити якість зображення за рахунок збільшення контрасту. Якщо встановити діаметр конфокальної діафрагми рівним діаметру центральної плями дифракційної картини точкового об'єкта (диску Ейрі), можна уникнути попадання в об'єктив світла від дифракційних кілець. Застосовуючи таку технологію, можна підвищити контрастність приблизно в 1,4 рази порівняно із звичайними мікроскопами, а це призведе до помітного покращення якості зображення. Аксіальна роздільна здатність конфокального мікроскопа також залежить від діаметра діафрагми. Чим менший діаметр діафрагми, тим менше товщина шару, з якого знімається сигнал, отже, краще аксіальний дозвіл (світло з сусідніх точок, що знаходяться поза фокальною площиною, затримується діафрагмою). Величина конфокальної діафрагми, що дорівнює розміру диска Ейрі, розраховується програмою, що управляє конфокальним мікроскопом, для кожного поєднання об'єктиву та використовуваних фільтрів (1 Airyunit). Вона легко може бути поставлена ​​без додаткових обчислень.

З більш докладним описом принципової схеми конфокального мікроскопа та порядком роботи його модулів можна ознайомитись у роботах Е. І. Лежнева [та ін.] (2001), Г. І. Штейна (2007); R. Y. Tsien (2006); B. J. Nair (2012).

Як зазначалося вище, конфокальної лазерної мікроскопії зображення всього зразка отримують шляхом сканування. Швидкість поточкового сканування обмежує швидкість роботи мікроскопа в цілому і унеможливлює спостереження за швидкоплинними процесами. Щоб уникнути цього обмеження, практично використовують не одиночну діафрагму, а масив діафрагм і детекторів. Такі масиви розміщують на диску Нипкова. Цей пристрій, винайдений Паулем Нипковим в 1884 р., є диск, що обертається з непрозорого матеріалу з нанесеними на ньому отворами однакового діаметра, розташованими по спіралі в один оборот, починаючи від зовнішнього краю диска. Спостерігаючи об'єкт через сектор диска Нипкова, що швидко обертається, можна помітити, що відбувається його постстрокове сканування. При більш високої швидкостіобертання об'єкт можна побачити повністю (Феофанов А. В., 2007).

Сучасний аналог диска Нипкова містить 20 тис. отворів, на яких лазерний промінь фокусується за допомогою додаткового дискаіз мікролінзами. При обертанні такого подвійного диска досягається зчитування до 360 кадрів за секунду. Однак варто зазначити, що діаметри отворів та відстані між ними на диску фіксовані та підбираються для конкретного об'єктива, отже, зміна останнього потребує заміни диска.

Сьогодні на зміну обертовим дискам Нипкова приходять їх твердотілі нерухомі аналоги - цифрові мікродзеркальні пристрої (digital micromirror device, DMD). Ці пристрої являють собою масиви мікродзеркал, які відповідають пікселям в зображенні, що проектується і, відхиляючись в той чи інший бік, керують проходженням світла. У конфокальній мікроскопії вони грають роль масиву отворів, що фільтрують сигнал, що повертається зразком, із змінним діаметром і схемою розстановки.

Однак конфокальні мікроскопи мають істотні недоліки. Так, збудження значної частини існуючих флуорохромів здійснюється лазерним випромінюванням ультрафіолетового або короткохвильового видимого діапазону, що є руйнівним для живих клітин. Ця проблема була подолана із введенням у практику мультифотонних мікроскопів, в яких як підсвічування використовується випромінювання інфрачервоного діапазону.

1.4. Мультифотонна мікроскопія

Мультифотонна мікроскопія – варіант лазерної скануючої конфокальної мікроскопії, заснований на принципі Гепперт-Майєр, згідно з яким із збільшенням щільності потужності світла зростає ймовірність поглинання атомом флуорохрому одночасно двох і більше фотонів, після чого атом випромінює фотон більшої енергії, ніж при однофотонному поглинанні. Незважаючи на те, що це явище було описано ще в 1931 р., перший мультифотонний мікроскоп був застосований для дослідження біологічних об'єктів Winfried Denk лише в 1990 р. Це було пов'язано з неможливістю до появи лазерної техніки досягти на практиці випромінювання великої щільності. У сучасних мультифотонних мікроскопах висока густина потужності світлового пучка забезпечується за рахунок фокусування лазерного випромінювання, а також завдяки зменшенню тривалості лазерного імпульсу. З цією метою застосовуються фемтосекундні лазери з тривалістю імпульсу близько 10 - 13 з (100 фемтосекунд) і частотою близько 100 МГц. Використання такої системи (при невисокій її потужності) дозволяє отримати сигнал із малим рівнем фонових шумівдосягти більшої глибини проникнення в тканини при малому ступені пошкодження клітин. Крім цього, за рахунок відсутності збудження і вицвітання флуорохромів поза фокальним обсягом відсутня необхідність встановлення конфокальної діафрагми, тому лазерний скануючий мікроскоп з мультифотонним збудженням не є типовим конфокальним мікроскопом. Як приклад мультифотонного мікроскопа можна навести комплекс лазерного скануючого конфокального мікроскопа Carl Zeiss LSM-710 з фемтосекундним інфрачервоним лазером з діапазоном, що перебудовується (800 – 1500 нм). Використання цієї системи дозволяє отримати глибину проникнення в тканини близько 500 мкм та здійснювати безперервний моніторинг живих об'єктів протягом кількох годин.

Одним із варіантів мультифотонної мікроскопії є мікроскопія з використанням реєстрації другої гармоніки (Second-harmonic imaging microscopy – SHIM).Метод генерації другої гармоніки заснований на нелінійному оптичному явищі, суть якого полягає у перетворенні середовищем двох фотонів із частотою wв один фотон із частотою 2w.Це означає, що окрім світла на частоті лазера із середовища виходить світло на подвоєній частоті – друга гармоніка. Генерація другої гармоніки обумовлена ​​розсіюванням світла в середовищі і можлива при дії лазерного поляризованого випромінювання ближнього інфрачервоного діапазону. Детальний виклад фізико-хімічних основ цього процесу наведено у підручнику за редакцією Б. І. Манцизова (2009). Не всі біологічні зразки можуть генерувати другу гармоніку. Класичним об'єктом для цього виду мікроскопії є рогівка ока, яка складається переважно з щільно упакованих колагенових волокон – джерела генерації другої гармоніки.

1.5. Конфокальна мікроскопія у застосуванні до дослідження динамічних процесів та міжмолекулярних взаємодій

1.5.1. Відновлення флуоресценції після відбілювання (Fluorescence Recovery After Photobleachin – FRAP)

Дана техніка застосовується для дослідження рухливості біоорганічних молекул, наприклад вимірювання коефіцієнта латеральної дифузії деякого білка або вивчення полімеризації білків. Основний принцип методу полягає в тому, що білок інтересу мітять флуоресцентною міткою, за допомогою ослабленого аттенюаторами збуджуючого випромінювання реєструють фонову флуоресценцію; після цього на короткий проміжок часу (кілька мілісекунд) збільшують інтенсивність опромінення, що призводить до випалювання флуорохрому; потім знижують інтенсивність до вихідної та реєструють флуоресценцію з вибіленої ділянки (Соболєв А. С., 2000). Якщо молекули з флуорохромом із сусідньої неопроміненої зони (наприклад, дифузією) переміщуються в опромінену область, то за часом наростання флуоресценції можна судити про їх рухливість. Кілька років тому було розроблено модифікацію цього методу – про братний FRAPабо iFRAP,який успішно застосовується вивчення рухливості молекул у малому обсязі чи кінетики дисоціації молекул. У цій модифікації фотовідбілювання піддаються флуоресцентно мічені молекули у всій клітині за винятком малого обсягу, потім реєструється зміна рівня флуоресценції в цьому обсязі (Dailey M. E. [et al.], 2006).

1.5.2. Втрата флуоресценції під час фотовідбілювання (Fluorescence Lossin Photobleaching – FLIP)

Техніка FLIP використовується виявлення взаємодій між молекулами з різних компартментів клітини чи вивчення рухливості молекули всередині компартмента. Наприклад, спостереження пересування певного білка з цитоплазми в ядро. Експерименти в техніці FLIP відрізняються від FRAP та iFRAP тим, що випалювання флуоресценції в одній і тій же області зразка проводиться кілька разів з метою запобігання відновленню флуоресценції. При повторному відбілюванні певної області виникає втрата флуоресценції у прикордонній області. За втратою флуоресценції в прикордонній області з опромінюваною можна судити про пересування фракції мічених флуоресцентним барвником білків і, навпаки, за залишковою флуоресценцією можна визначити частку нерухомих молекул. FLIP часто використовується в комбінації з FRAP, щоб отримати узагальнену інформацію про активне та пасивне переміщення мічених білків.

1.5.3. Локалізація флуоресценції після відбілювання (Fluorescence Localization After Photobleaching – FLAP)

За допомогою методу FLAP можна реально стежити за переміщенням флуоресцентно міченої молекули в просторі. Техніка FLAP була розроблена Graham Dunn у 2002 р. і полягала в тому, що до молекул інтересу пришивали дві різні флуоресцентні мітки, одну з яких відбілювали, а за допомогою другої стежили за переміщенням молекули. Для реалізації цього методу обидва барвники повинні візуалізуватися одночасно і незалежно, тоді FLAP сигнал отримують шляхом віднімання вибіленого сигналу з невибіленого для кожного пікселя.

1.5.4. Ферстерівська (флуоресцентна) резонансна передача енергії (Fӧrster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer – FRET)

Ферстерівська резонансна передача енергії, або інакше диполь-дипольне перенесення енергії, – це механізм перенесення енергії між двома молекулами (від донора до акцептора), який відбувається без проміжного випромінювання фотонів і є результатом диполь-дипольної взаємодії між донором, що перебуває у збудженому стані, та акцептором. Характерна риса цього процесу - гасіння флуоресценції донора і виникнення більш довгохвильової флуоресценції у акцептора, яка детектується конфокальним мікроскопом. При цьому перенесення збудження супроводжується зменшенням часу життя та квантового виходу флуоресценції донора, для якого акцептор виступає як гаситель. Швидкість перенесення зменшується як r–6 , де r– відстань між донором та акцептором, що використовується для вимірювання відстані між двома молекулами або між двома мітками в одній молекулі. Для характеристики цього явища вводиться поняття фестерівського радіусу ( R F) – це ефективне відстань, у якому швидкість переходу становить 50 % від максимуму (більшість систем його величина становить 20 – 50 Å). Якщо відстань між донором та акцептором перевищує 10 нм, то диполь-дипольне перенесення енергії не можливе. Крім відстані швидкість перенесення залежить від ступеня перекриття спектрів випускання донора і поглинання акцептора, від взаємної орієнтації диполів донора і акцептора і від часу життя збудженого стану донора без акцептора. Константа швидкості перенесення енергії k etвизначається виразом:

де d - час життя збудженого стану донора без акцептора.

Для реалізації технології FRET необхідно, щоб:

1) донорний зонд мав достатній час життя для здійснення перенесення енергії;

2) молекули донора і акцептора розташовувалися з відривом 1 – 10 нм друг від друга;

3) спектр поглинання флуорохрому акцептора накладався на спектр випромінювання флуоресценції флуорохрому донора (приблизно на 30%);

4) для перенесення енергії орієнтації диполя донора та акцептора були приблизно паралельні один одному;

5) пари флуорохромів відповідали наявним у конструкції мікроскопа лазерам.

Найчастіше використовувані пари донор – акцептор наведено у огляді, що на сайті http://www.mdpi.com/ 1420-3049/17/4/4047р. 4088.

Існує кілька методів досліджень FRET: фотовідбілювання акцептора/донора; метод спектральної конфокальної мікроскопії у застосуванні до FRET; мікроскопія для дослідження часу життя флуоресценції (fluorescence lifetime imaging microscopy – FLIM) та метод поляризації флуоресценції (Ishikawa-Ankerhold Н. С., 2012). Залежно від задачі, дані модифікації методу FRET дозволяють стежити за конформаційними змінами в білках, вивчати кінетику ферментативних реакцій, досліджувати білок-білкові та інші взаємодії. Наприклад, по зміні FRET-сигналу між Gá і Gâã субодиницями G-білка, злитими з флуоресцентними білками CFP та YFP, можна охарактеризувати динамічні характеристики дисоціації G-білка в живих клітинах; дві субодиниці нікотинових ацетилхолінових рецепторів á4 і â2, злиті з YFP і CFP, послужили основою для розробки клітинних систем, на основі яких із застосуванням спектральної конфокальної мікроскопії показана можливість вимірювати рівень á4â2-рецепторів та вивчати процеси їх складання-диссоци. За допомогою методики FLIM змогли в системі реального часу відслідковувати рівень фосфорильованої форми епідермального фактора росту (ЕФР), для чого до ЕФР пришили GFP, а до антитіл, що реагують з фосфоЕФР, - Cy3 (Grigsby C. L. , 2012; Zeug A. , .

Література

Голишевська Ст І., Єгорова О. Ст, Севастьянова Е. Ст, Шульгіна М. Ст.Люмінесцентна мікроскопія: навчальний посібник щодо курсів навчання: «Культуральні методи діагностики туберкульозу», «Виявлення туберкульозу методом мікроскопії». - М.; Тверь: Тріада, 2008. - 36 с.

Лукашева Н. Н., Ткаченко С. Б., Потєкаєв Н. Н., Кузьміна Т. С., Василевська Є. А.Прижиттєва відбивна конфокальна лазерна мікроскопія, що сканує: історія створення, принцип роботи, можливості застосування в дерматології // Клінічна дерматологія і венерологія. - 2008. - № 5. - С. 10 - 15.

Манцизов Б. І.Когерентна та нелінійна оптика. - М.: ФІЗМАТЛІТ, 2009. - 208 с.

Олійников В. А. Напівпровідникові флуоресцентні нанокристали (квантові точки) у білкових биочипах // Біоорг. хімія. - 2011. - 37 (2). - С. 171 - 189.

Сайфітдінова А. Ф.Двовимірна флуоресцентна мікроскопія для аналізу біологічних зразків: навчально-методичний посібник. - СПб.: СОЛО, 2008. - 72 с.

Соболєв А. С.Як вимірюють рухливість макромолекул у живих клітинах // Соросівський освітній журнал. - 2000. - Т. 6. - № 4. - С. 2 - 6.

Феофанов А. В.Спектральна лазерна скануюча конфокальна мікроскопія у біологічних дослідженнях // Успіхи біологічної хімії. - 2007. - Т. 47. - С. 371 - 410.

Фейнман Р.Фейнманівські лекції з фізики: в9 т. - 6-езд. сущ. випр. - М.: УРСС: Видавничий дім «ЛІБРОКОМ», 2011. - Т. 3: Випромінювання. Хвилі. Кванти. - 264 с.

Штейн Г. І.Посібник з конфокальної мікроскопії. - СПб.: ІНЦ РАН, 2007. - 77 с.

Dailey M. E., Manders E., Soll D., Terasaki M. Chapter 19 Confocal Microscopy в Live Cells In "Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd Ed.". - New York: Springer, 2006. - Р. 381 - 404.

Grigsby C. L., Ho Y. P., LeongK. W.Підприємство безвірусної нуклеїчної хімічної дії з quantum dot-FRET наносенсорами // Nanomedicine (Lond). - 2012. - Vol. 7 (4). - P. 565 - 577.

Ishikawa-Ankerhold H. C., Ankerhold R., Drummen G. P. C. Advanced Fluorescence Microscopy Techniques - FRAP, FLIP, FLAP, FRET і FLIM // Molecules. - 2012. - Vol. 17. - Р. 4047 - 4132.

Nair B. J., Sivakumar T. T., Joseph A. P., Varun B. R., Mony V. Confocal microscopy // Health Sciences. - 2012. - 1 (3): JS004A. - Р. 1 - 6.

Tsien R. Y., Ernst L., Waggoner A. Fluorophores for Confocal Microscopy: Photophysics and Photochemistry У «Книжковий друк Biological Confocal Microscopy, 3rd Ed.». - New York: Springer, 2006. - Р. 338 - 352.

Zeug A., Woehler A., ​​Neher E., Ponimaskin E. G. Quantitative intensity-на основі FRET approaches – a comparative snapshot // Biophys. J. - 2012. - Vol. 103 (9). - Р. 1821 - 1827.

* * *

Наведений ознайомлювальний фрагмент книги Молекулярна морфологія Методи флуоресцентної та конфокальної лазерної мікроскопії (Коллектив авторів, 2014)наданий нашим книжковим партнером -